生物样本透射电镜（TEM）

1.项目介绍

生物透射电子显微镜（TEM）是一种最高分辨率可达 0.1–0.2 nm 的显微镜，是观察和研究生物超微结构的重要工具。在生物科学研究中，生物 TEM 可用于观察细胞整体结构及亚细胞结构，包括（植物）细胞壁、细胞膜、细胞核及各种细胞器的变化，以及外源物质（如病原微生物、纳米颗粒）与细胞的相互作用，如外源物质的进入方式、细胞内分布及细胞对外界刺激的反应（自噬、凋亡、坏死等）。

1.1 主要用于生物样品（细胞、生物组织）内部形貌的分析与研究。

1.2 样品需经包埋、超薄切片、染色等工序制备成 TEM 样品。

1.3 通过透射电镜观察样品内部的组织形貌。

2.样品要求

2.1 前处理方法

通用要求：收集细胞或组织样品（需新鲜迅速取材），置于 1.5 mL 尖底离心管内，加入预冷的终浓度为 2.5% 戊二醛和 2% 多聚甲醛固定液（固定液加至离心管的 4/5，确保样品完全浸没），于 4℃ 过夜固定。请勿倒弃固定液，一般固定 12 小时或过夜后可寄送。

细胞类：收集 10⁶ 以上的细胞。用新鲜培养液处理细胞后，以细胞刮刀或酶消化法收集细胞，加入预冷的终浓度为 2.5% 戊二醛和 2% 多聚甲醛溶液，固定半小时。以 1500–3000 转/分钟离心 5–10 分钟，收集细胞至管底可见黄豆或绿豆大小，弃上清，沿管壁缓慢加入 4℃ 新鲜固定液，置于 4℃ 冰箱过夜。

组织类：新鲜取材，取材位置应准确，组织大小尽量控制在 1–2 mm³（长 1–5 mm × 宽 1 mm × 高 1 mm）。离体后请尽快投入 4℃ 预冷的固定液中，置于 4℃ 冰箱固定过夜。

细菌类：吸取 OD₀.₅–₀.₈ 的培养物，加入预冷的终浓度为 2.5% 戊二醛和 2% 多聚甲醛溶液，固定半小时。以 3000–5000 转/分钟离心 5–10 分钟，弃上清，收集菌体沉淀至管底黄豆大小。可用预冷 pH 7.2 的磷酸缓冲液（PB）清洗 1–2 次，弃上清，沿管壁缓慢加入 4℃ 新鲜固定液，置于 4℃ 冰箱过夜。

样本标识：建议按字母或数字编号，标记清晰，确保样本量充足。

2.2 送样要求

2.2.1 样品需用戊二醛固定，一般固定 2 小时即可冰袋运输（特殊样品需延长固定时间）。戊二醛用量应充足，样品管内保留一定量的空气。

2.2.2 EP 管需用封口膜封口（防止漏液），管外用泡沫包裹，避免低温冰冻导致样品结冰。

2.2.3 样品中固体含量至少为芝麻粒大小，细胞和菌类样品需为米粒大小。生物新鲜组织取材后应立即放入相应浓度的戊二醛固定液（不超过 1 分钟），以减少自溶。戊二醛需预冷至 4–10℃ 后使用。

2.2.4 常规送样方式为 4℃ 冰袋冷藏运输。如需冷冻送样，请在订单中特别指明。

2.2.5 本项目不支持样品回收，请自行保留备份。

2.2.6 可测试样品类型：细菌、细胞、生物组织等。

2.2.7 请尽量注明图片标尺或具体拍摄内容，可输出的标尺包括 10 μm、5 μm、2 μm、1 μm、500 nm、200 nm 和 100 nm。如未注明标尺要求，实验室不接受因标尺问题导致的免费补拍或重拍。

3.常见问题

3.1 为什么通过光镜（免疫荧光等）和分子实验（ELISA/WB等）观察到自噬、凋亡等现象，摸索出信号最强的时间点取材，结果电镜下细胞不是结构烂就是没有期待的结构呢？可能的原因有哪些？

答：光镜和分子水平的变化与超微结构变化不完全平行！是基本上从来都不准确同步的，所以已经做了其他实验后想来看自噬和凋亡的，不一定能看到，铁死亡、外泌体等都有这个问题。

可能的原因有：

①光镜分辨率不够，看上去阳性的东西，可能根本不在预期结构上。比如，线粒体相关的某标记物，光镜下看到胞质里阳性颗粒很多了，结果电镜下完全没有。精细实验后发现标记的其实是某些溶酶体。

②生理或病理过程本身的原因。比如有老师来看凋亡，给了荧光照片，胞核标记物超级清楚，结果电镜下细胞很烂。也有给了WB结果，选的阳性最强的时段取材，结果电镜下细胞完好。他们都是同一板细胞分取的。可能分子结果反映的是表达没有，表达了不见得正在发挥作用，形态还是好的。荧光都看到了，那细胞崩裂已经开始，镜下就好不了。

3.2 动物普通组织取材、送样？

取材原则：切薄并尽快投入固定液；注意下述要求。

①请尽快固定。动物组织最好在离体后1 min内开始固定。

②非灌注的组织，厚度不超过4 mm，请用恰当方式（比如切宽薄片）体现位置和层次关系。尽量不要事先切成很小的颗粒。

③请用锋利薄刀片切组织，朝一个方向划，不要来回切割，不要挤压、拉扯。

④含有食物残渣（如消化道）、大量血液（如心肌）或其它黏附物（如乳腺等）的组织，请用生理盐水快速漂洗，再投入固定液。

⑤请保证固定液量充足。固定液和组织的体积比不小于20 : 1。

⑥最初的30 min以后，最好在4 ℃的固定液中浸泡，严禁结冰（太靠近冰箱后壁或冰袋运输都可能使组织结冰。冬季宁可常温送样）。

3.3 培养细胞常规简易取材、送样？

①最好刮取细胞，收集在离心管中，1500 rpm离心5 ~ 10 min（该参数可按自己的经验调整，目的是不损伤细胞结构的情况下去掉培养液成分）。

②弃上清，加入固定液重悬细胞。

③细胞悬液尽快（1分钟内，久了离心难以紧固）转移至1.5 ml尖底EP管，立即以10000 r/min离心12 min（该参数适用于一般小型台式离心机，不可随意更改，务必使细胞离紧不散）；离紧后的细胞约半颗绿豆大小，切不可太大。

④静置15 min，然后小心弃上清，再沿管壁缓慢加入室温或4 ℃固定液（不可冲击、吹散细胞）。

⑤在4 ℃保存或运输。严禁结冰（太靠近冰箱后壁或冰袋运输都可能使组织结冰。冬季宁可常温送样）。

3.4 固定液类型及介绍？

大多数动物组织和培养细胞，提供2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液。专门观察神经髓鞘的，提供3%戊二醛＋Plus辅剂（临用前5 min内混合）；观察厚壁真菌或细菌芽孢等，提供K-T固定液。具体根据样本类型选择合适的固定液，并非完全统一。